Чуб В.В. - Молекулярная генетика развития растений - 4. Трансгенные растения в исследованиях

• Лекция посвящена использованию трансгенных растений в исследованиях.  

• Методы включают ДНК и РНК технологии, инсерционный мотогенез, гиперэкспрессию, анализ промоутеров и паттернов экспрессии генов.  

• Трансформация растений приводит к мутациям, что важно учитывать при анализе генома.  

• Транспазоны могут перемещаться внутри хромосомы, вызывая мутации.  

• Конструируются конструкции с терминальными инвертированными повторами и сильным промотором.  

• Транспозаза вырезает и транспонирует транспазоны, что позволяет целенаправленно мутировать хромосомы.  

• Гиперэкспрессия используется для активации генов в разных тканях.  

• Промотеры агробактерий и вирусы, такие как вирус мозаики цветной капусты, применяются для экспрессии генов.  

• Разнообразие промоутеров важно для предотвращения сайленсинга.  

• Промоутеры генов домашнего хозяйства, таких как актив и биквитин, используются для экспрессии белков.  

• Промоутеры для фотосинтезирующих тканей, такие как малая субъединица рубиско, активируются на свету.  

• Эти промоутеры могут работать как в двудольных, так и в однодольных растениях.  

• Бионформатики создают синтетические промоутеры на основе регуляторных элементов.  

• Ауксин-зависимый промотор DR5 позволяет наблюдать за распределением ауксина.  

• Минимальные синтетические промоутеры обеспечивают высокую экспрессию во всем растении.  

• Метод анализа промоутеров был разработан Нам Хайчуа.  

• Укорачивание промоутера и исследование активности гена позволили выявить регуляторные элементы.  

• Современные методы облегчили анализ промоутеров, сохраняя принцип делеций и репортерных генов.  

• Глюкуронидаза Гус используется как репортерный ген.  

• Гус расщепляет глюкуроновые кислоты и их эфиры.  

• Для выявления ферментативной активности используется искусственный гликозит.  

• Гус окрашивает ткани в синий цвет, что позволяет отслеживать активность промоутеров.  

• Пример: белок Пин7, связанный с транспортом ауксина, окрашивает стеллу и терминальную часть зародыша.  

• Пример: рецепторная киназа, экспрессирующаяся в рыльцах за три дня до цветения.  

• Метод требует убийства объекта и использования большого количества растений.  

• Невозможно отследить дальнейшие шаги развития.  

• Фиксирует результат на определенный момент времени.  

• Гус под промоутером фенилаланин-аммиак лиазы используется для изучения иммунного ответа растений.  

• Фенилаланин-аммиак лиаза контролирует иммунный ответ и лигнификацию.  

• Пример: заражение табака фитофторой показывает иммунную реакцию растений.  

• Зеленый флюоресцентный белок используется для отслеживания процессов без убийства объекта.  

• Пример: промоутер ДР5 показывает распределение ауксина в зародыше.  

• Метод позволяет следить за развитием без фиксации листьев.  

• Генные инженеры модифицируют белки для изменения спектра излучения.  

• Пример: замена тирозина на гистидин создает синий флюоресцентный белок.  

• Модификация позволяет следить за двумя процессами одновременно.  

• Красный флюоресцентный белок ДС Ред светится в красной области.  

• Пример: использование ДС Ред для маркировки трансформированных растений.  

• Современные флюоресцентные белки позволяют решать различные задачи.  

• Люцифераза из сверчков выделяет свет при окислении люциферина.  

• Пример: использование люциферазы под хлорофилл аб-связывающим белком.  

• Обязательный этап методики — пропитка растений люциферином для регистрации свечения.  

• Светлячковый люциферин токсичен в больших концентрациях.  

• Успех зависит от равномерного распределения люциферина.  

• Перспективное направление - использование люциферазы грибов, особенно рода нетопанов.  

• Грибная люцифераза работает с фенилпропаноидами, такими как гиспидин.  

• Гиспидин синтезируется из кофейной кислоты под действием пидин-синтазы.  

• Грибная люцифераза позволяет следить за фенольным метаболизмом растений.  

• Грибная люцифераза позволяет отслеживать фенольный метаболизм.  

• Свет в зеленой области не возбуждает хлорофилл, что облегчает наблюдение.  

• Трансгенные конструкции могут светиться при механических повреждениях.  

• Люцифераза показывает циркадные движения растений.  

• Фенольный метаболизм активен в зацветающих растениях.  

• Люцифераза позволяет отслеживать физиологические процессы в растениях.  

• Бета-цианины синтезируются из тирозина и гликозилируются.  

• Эти вещества придают растениям свекольную окраску.  

• Генные инженеры используют конструкцию "руби" для окрашивания тканей.  

• "Руби" состоит из трех ферментов, которые окрашивают ткани.  

• Конструкция позволяет различать трансгенные и не трансгенные растения.  

• "Руби" используется для анализа различных промоутеров.  

• "Руби" показывает реакцию клеток на ауксин.  

• Конструкция упрощает наблюдение, но не позволяет отслеживать выключение генов.  

• "Руби" используется для трансформации различных объектов, включая томаты и баклажаны.  

• Бета-цианины делают растения устойчивыми к грибным заболеваниям.  

• Эти вещества полезны для человека как антиоксиданты.  

• "Руби" помогает локализовать инфекции и делает растения более устойчивыми.  

• Проект по поиску новых промоутеров с использованием конструкции устойчивости к гигромицину.  

• Промоу  

• Эктопическая экспрессия предполагает активность промотера в неправильных местах.  

• Пример: мутант нотте кукурузы, у которого промотер не выключался в листьях, что приводило к очагам пролиферации.  

• Это первый ген с гомеобоксом, обнаруженный у растений.  

• Используются промотеры от одного гена и кодирующая часть от другого.  

• Пример: ген а-тугумента активен в примордиях листьев, что предотвращает их дифференцировку.  

• Ген стм активен в мире стеме, что приводит к пролиферации и изменению формы листьев.  

• Линия драйвера содержит интересующий промотор и генно-инженерную конструкцию.  

• Лак репрессор узнает регуляторный лак-оператор и активирует экспрессию эукариотических генов.  

• Пример: промотор петля один и ген петел лос, что приводит к потере лепестков и остановке развития цветка.  

• Индуцибельная экспрессия запускается при воздействии экспериментатора.  

• Используются промоутеры белков теплового шока и холодового стресса.  

• Пример: белки теплового шока усиливают функции фолдинга при повышении температуры.  

• Белки теплового шока продолжают работать даже при нормальной температуре.  

• Это может привести к постоянной экспрессии при пониженной температуре.  

• Пример: ген глюкоронидазы под промоутером теплового шока, который активируется при нагревании.  

• Эвкалипт зацветает поздно, что неудобно для селекции.  

• Флориген ФТ, белок теплового шока, используется для раннего цветения.  

• После индукции белком теплового шока, цветки образуются через девять недель.  

• Мелкие семена эвкалиптов позволяют проводить скрещивание.  

• Белки холодового шока борются с образованием кристаллов при низких температурах.  

• Эти белки важны для выживания при температурах ниже нуля.  

• При засухе и холоде активируются гены, связанные с холодовым шоком.  

• Фактор транскрипции AP2/ERF реагирует на холод и засуху.  

• Специальный элемент отвечает на понижение температуры и засуху.  

• Глюкокортикоиды используются для регуляции генов в растениях.  

• Химерный белок связывает глюкокортикоиды и запускает экспрессию генов.  

• Система не работает без глюкокортикоидов, что предотвращает "подтекание".  

• Мутанты без волосков используются для изучения регуляции генов.  

• Генная инженерия компенсирует генетический недостаток.  

• Обработка дексаметазоном вызывает образование волосков на листьях.  

• Эстрогены человека используются для индукции генов.  

• Глюкуронидаза служит репортером для оценки экспрессии генов.  

• Этанол используется для быстрой индукции генов в растениях.  

• Фактор транскрипции ZAP запускает ген алкогольдегидрогеназы.  

• Этанол вызывает линейную экспрессию генов.  

• Люцифераза светлячка используется для визуализации реакции на этанол.  

• Белок рецептор тетрациклина связывается с факторами транскрипции.  

• Тетрациклин вызывает индукцию или выключение генов.  

• Репортерная линия реагирует на присутствие тетрациклина.  

• Метод выключения генов, открытый в 1978 году Полем-Замечником.  

• Смысловая и антисмысловая РНК образуют двойную спираль, которая уничтожается клеткой.  

• Достаточно небольшого участка гена для антисенс-косупрессии.  

• Промоутер пришивается к кодирующей части гена для создания антисмысловой РНК.  

• Антисмысловая РНК уничтожает смысловую РНК, блокируя синтез белка.  

• Сайленсинг используется для выключения активных генов.  

• Антисмысловые олигонуклеотиды блокируют синтез белка.  

• Рибозимы разрезают РНК, предотвращая синтез белка.  

• Малые интерферирующие РНК разрушают РНК, блокируя синтез белка.  

• Сайленсинг впервые обнаружен на петунии для борьбы с вирусами.  

• Малые интерферирующие РНК блокируют транскрипцию и деградацию РНК.  

• Сайленсинг может охватывать целые растения и органы.  

• Сайленсинг используется для изменения структуры и биохимии растений.  

• Примеры: изменение структуры цветка и биохимии хризантемы.  

• Разрабатываются пестициды на основе малых интерферирующих РНК.  

• Сайленсинг эффективен против насекомых, грибов и вирусов.  

• Проблемы: устойчивость насекомых и необходимость стабилизации РНК.  

• Перспективы: борьба с вирусами и грибами, но не все насекомые чувствительны.  

• Технология разрушения белкового продукта.  

• Пример: деградация факторов ауксина для регуляции транскрипции.  

• Взаимодействие с системой убиквитинирования для деградации белков.  

• Venus - вариант желтого флюоресцентного белка, который быстро деградирует.  

• Декрон D2 позволяет Venus быстро деградировать.  

• Контроль показывает, что стабилизированный домен D2 не взаимодействует с Tyr1.  

• В начале геоиндукции Venus равномерно распределен в ядрах.  

• Через 30 минут ядра на нижней стороне перестают светиться, что указывает на перетекание ауксина.  

• Контроль показывает, что Venus не деградирует даже через 120 минут.  

• Модификации белка Tyr1 для реакции на модифицированные молекулы.  

• Добавление D2 к белку интереса вызывает его деградацию при наличии модифицированной молекулы.  

• Система используется для деградации белков в разных частях организма.  

• Компонент Cas9 взаимодействует с гидовой РНК и ДНК.  

• Добавление ауксина вызывает деградацию комплекса, что приводит к яркому свечению ядер.  

• Аналогичные системы используются для отслеживания концентраций гиберелина и жасмоната.  

• Рекомбинация используется для полного удаления генов.  

• Фаговая система и система дрожжей позволяют вырезать ненужные последовательности.  

• Это важно для удаления последствий генной инженерии и генетического мусора.  

• Технология увеличивает продажи семян, привязывая фермеров к производителю.  

• Включает индуцибельную тетрациклином систему и рекомбиназу флипазу.  

• При обработке тетрациклином удаляется спейсер, что приводит к гибели зародыша.  

• Использование токсинов для уничтожения групп клеток.  

• Пример с токсином дифтерии, который вызывает отмирание цветков.  

• Система барназа-барстар позволяет отменить генетическую хирургию.  

• Важна для селекционеров для удобства скрещиваний.  

• Возможность получения фертильных растений из семян с мужской стерильностью.  

• Выделен ген, экспрессирующийся в эдотециуме у пыльников гороха.  

• Ген перенесен в пеларгонию зональную, что привело к отмиранию тканей пыльника.  

• Для отмены действия барназы используется ген барназе старвейшн.  

• Две линии: одна продуцирует пыльцу, другая стерильна.  

• Совместная экспрессия барста и барназы приводит к восстановлению мужской стерильности.  

• Этот подход используется для создания искусственных линий с мужской стерильностью.  

• Широко используется система CRISPR-Cas9.  

• Cas9 связывается с гидовой РНК и вносит одноцепочечные разрывы в ДНК.  

• Cas9 можно модифицировать для различных целей, включая отслеживание событий в геноме и модификацию генома.  

• Система цинковых нуклеаз на основе факторов транскрипции.  

• Система таллин-транскрипшн-активатор-эффектор нуклеазы.  

• Эти системы сложны в сборке и тестировании, но могут использоваться для редактирования генома.  

• Гомологичная репарация у растений встречается редко.  

• Для повышения вероятности используют методы, такие как неинфекционный репликон и генную пушку.  

• Эти методы позволяют внедрять новые последовательности в геном.  

• Система удобна для редактирования генома и визуализации процессов.  

• Cas9 используется для нокаута генов и вставки новых последовательностей.  

• Дополнительные домены химерных белков позволяют включать и выключать гены и визуализировать их активность.  

• Нокауты используются для изменения метаболизма растений.  

• Изучают метаболизм и направляют его в нужную сторону с помощью редактирования генома.  

• Примеры: удаление белкового фактора для увеличения накопления метаболита Ф.  

• Ферменты могут быть ингибированы или активированы транскрипционными факторами.  

• Нокаут помогает снять ингибирование и ускорить метаболизм.  

• Использование микро-РНК для выключения конкурирующих ферментов.  

• Строятся математические модели для изучения метаболизма.  

• Инжиниринг метаболизма хорошо работает в прокариотических системах.  

• В растениях метаболизм сложнее, но успехи есть.  

• Работа над продукцией вторичных метаболитов и лекарственных соединений.  

• Пример с томатами: изменение цвета и накопление каротиноидов.  

• Нокаут генов для увеличения витаминной ценности томатов.  

• Использование системы CRISPR для исправления мутаций.  

• Пример с мутантом по кортиноид изомеразе: восстановление нормального цвета томатов.  

• Система CRISPR позволяет исправлять мутации в геноме.  

• Использование системы CRISPR для замены нуклеотидов.  

• Прицельная замена нуклеотидных пар для изменения последовательности.  

• Методы молекулярной биологии постоянно обновляются.  

• Уничтожение групп клеток для генетической хирургии.  

• Пример с токсином дифтерии для уничтожения цветков.  

• Использование системы барназа-барстар для отмены генетической хирургии.  

• Получение мужской стерильности у растений для селекции.  

• Возможность отмены мужской стерильности для получения фертильных растений.  

• Выделен ген из гороха, экспрессирующийся в пыльниках.  

• Ген перенесен в пеларгонию зональную, что привело к отмиранию тканей пыльника.  

• Для отмены действия барназы используется ген барназе старвейшн.  

• Две линии: одна продуцирует пыльцу, другая стерильна.  

• Совместная экспрессия барста и барназы восстанавливает мужскую стерильность.  

• Подход используется для создания искусственных линий с мужской стерильностью.  

• Система CRISPR-Cas используется для редактирования генома.  

• Cas9 вносит одноцепочечные разрывы в ДНК.  

• Cas9 можно модифицировать для различных целей, включая отслеживание событий в геноме.  

• Система цинковых пальцев использует белки с цинковыми пальцами для узнавания последовательностей.  

• Система TALEN использует повторы и гипервариабельные аминокислоты для узнавания нуклеотидов.  

• Обе системы сложны в сборке и тестировании.  

• Преобладает негомологичное сшивание концов.  

• Гомологичная репарация встречается редко, но используется для нокаута генов.  

• Для повышения вероятности гомологичной репарации используются методы, такие как генной пушки.  

• Система удобна для редактирования и визуализации генома.  

• Cas9 используется для нокаута генов и вставки новых последовательностей.  

• Дополнительные домены химерных белков позволяют включать и выключать гены, а также визуализировать их активность.  

• Нокауты используются для изменения метаболизма растений.  

• Изучают цепочку метаболитов и целевой продукт.  

• Воздействуют на ферменты с помощью редактирования генома.  

• Обратная отрицательная связь и ингибирование ферментов.  

• Нокаут для снятия ингибирования и ускорения метаболизма.  

• Экспрессия активаторов транскрипции для увеличения ферментов.  

• Строятся математические модели для изучения метаболизма.  

• Инжиниринг метаболизма эффективен в прокариотических системах.  

• В растениях подход менее развит, но успехи есть.  

• Модельная система: созревание плодов томатов.  

• Регулирование ферментов для изменения цвета томатов.  

• Нокаут генов для увеличения витаминной ценности томатов.  

• Использование системы репликации гемини-вирусов.  

• Исправление мутаций с помощью системы CRISPR-Cas.  

• Прицельная замена нуклеотидов для тонкой работы с геномом.  

• Методы молекулярной биологии постоянно обновляются.  

• Исследования в других системах применяются на растениях.  

• Основные методы для исследования генома растений и получения практических результатов.