Лекция посвящена использованию трансгенных растений в исследованиях.
Методы включают ДНК и РНК технологии, инсерционный мотогенез, гиперэкспрессию, анализ промоутеров и паттернов экспрессии генов.
Трансформация растений приводит к мутациям, что важно учитывать при анализе генома.
Транспазоны могут перемещаться внутри хромосомы, вызывая мутации.
Конструируются конструкции с терминальными инвертированными повторами и сильным промотором.
Транспозаза вырезает и транспонирует транспазоны, что позволяет целенаправленно мутировать хромосомы.
Гиперэкспрессия используется для активации генов в разных тканях.
Промотеры агробактерий и вирусы, такие как вирус мозаики цветной капусты, применяются для экспрессии генов.
Разнообразие промоутеров важно для предотвращения сайленсинга.
Промоутеры генов домашнего хозяйства, таких как актив и биквитин, используются для экспрессии белков.
Промоутеры для фотосинтезирующих тканей, такие как малая субъединица рубиско, активируются на свету.
Эти промоутеры могут работать как в двудольных, так и в однодольных растениях.
Бионформатики создают синтетические промоутеры на основе регуляторных элементов.
Ауксин-зависимый промотор DR5 позволяет наблюдать за распределением ауксина.
Минимальные синтетические промоутеры обеспечивают высокую экспрессию во всем растении.
Метод анализа промоутеров был разработан Нам Хайчуа.
Укорачивание промоутера и исследование активности гена позволили выявить регуляторные элементы.
Современные методы облегчили анализ промоутеров, сохраняя принцип делеций и репортерных генов.
Глюкуронидаза Гус используется как репортерный ген.
Гус расщепляет глюкуроновые кислоты и их эфиры.
Для выявления ферментативной активности используется искусственный гликозит.
Гус окрашивает ткани в синий цвет, что позволяет отслеживать активность промоутеров.
Пример: белок Пин7, связанный с транспортом ауксина, окрашивает стеллу и терминальную часть зародыша.
Пример: рецепторная киназа, экспрессирующаяся в рыльцах за три дня до цветения.
Метод требует убийства объекта и использования большого количества растений.
Невозможно отследить дальнейшие шаги развития.
Фиксирует результат на определенный момент времени.
Гус под промоутером фенилаланин-аммиак лиазы используется для изучения иммунного ответа растений.
Фенилаланин-аммиак лиаза контролирует иммунный ответ и лигнификацию.
Пример: заражение табака фитофторой показывает иммунную реакцию растений.
Зеленый флюоресцентный белок используется для отслеживания процессов без убийства объекта.
Пример: промоутер ДР5 показывает распределение ауксина в зародыше.
Метод позволяет следить за развитием без фиксации листьев.
Генные инженеры модифицируют белки для изменения спектра излучения.
Пример: замена тирозина на гистидин создает синий флюоресцентный белок.
Модификация позволяет следить за двумя процессами одновременно.
Красный флюоресцентный белок ДС Ред светится в красной области.
Пример: использование ДС Ред для маркировки трансформированных растений.
Современные флюоресцентные белки позволяют решать различные задачи.
Люцифераза из сверчков выделяет свет при окислении люциферина.
Пример: использование люциферазы под хлорофилл аб-связывающим белком.
Обязательный этап методики — пропитка растений люциферином для регистрации свечения.
Светлячковый люциферин токсичен в больших концентрациях.
Успех зависит от равномерного распределения люциферина.
Перспективное направление - использование люциферазы грибов, особенно рода нетопанов.
Грибная люцифераза работает с фенилпропаноидами, такими как гиспидин.
Гиспидин синтезируется из кофейной кислоты под действием пидин-синтазы.
Грибная люцифераза позволяет следить за фенольным метаболизмом растений.
Грибная люцифераза позволяет отслеживать фенольный метаболизм.
Свет в зеленой области не возбуждает хлорофилл, что облегчает наблюдение.
Трансгенные конструкции могут светиться при механических повреждениях.
Люцифераза показывает циркадные движения растений.
Фенольный метаболизм активен в зацветающих растениях.
Люцифераза позволяет отслеживать физиологические процессы в растениях.
Бета-цианины синтезируются из тирозина и гликозилируются.
Эти вещества придают растениям свекольную окраску.
Генные инженеры используют конструкцию "руби" для окрашивания тканей.
"Руби" состоит из трех ферментов, которые окрашивают ткани.
Конструкция позволяет различать трансгенные и не трансгенные растения.
"Руби" используется для анализа различных промоутеров.
"Руби" показывает реакцию клеток на ауксин.
Конструкция упрощает наблюдение, но не позволяет отслеживать выключение генов.
"Руби" используется для трансформации различных объектов, включая томаты и баклажаны.
Бета-цианины делают растения устойчивыми к грибным заболеваниям.
Эти вещества полезны для человека как антиоксиданты.
"Руби" помогает локализовать инфекции и делает растения более устойчивыми.
Проект по поиску новых промоутеров с использованием конструкции устойчивости к гигромицину.
Промоу
Эктопическая экспрессия предполагает активность промотера в неправильных местах.
Пример: мутант нотте кукурузы, у которого промотер не выключался в листьях, что приводило к очагам пролиферации.
Это первый ген с гомеобоксом, обнаруженный у растений.
Используются промотеры от одного гена и кодирующая часть от другого.
Пример: ген а-тугумента активен в примордиях листьев, что предотвращает их дифференцировку.
Ген стм активен в мире стеме, что приводит к пролиферации и изменению формы листьев.
Линия драйвера содержит интересующий промотор и генно-инженерную конструкцию.
Лак репрессор узнает регуляторный лак-оператор и активирует экспрессию эукариотических генов.
Пример: промотор петля один и ген петел лос, что приводит к потере лепестков и остановке развития цветка.
Индуцибельная экспрессия запускается при воздействии экспериментатора.
Используются промоутеры белков теплового шока и холодового стресса.
Пример: белки теплового шока усиливают функции фолдинга при повышении температуры.
Белки теплового шока продолжают работать даже при нормальной температуре.
Это может привести к постоянной экспрессии при пониженной температуре.
Пример: ген глюкоронидазы под промоутером теплового шока, который активируется при нагревании.
Эвкалипт зацветает поздно, что неудобно для селекции.
Флориген ФТ, белок теплового шока, используется для раннего цветения.
После индукции белком теплового шока, цветки образуются через девять недель.
Мелкие семена эвкалиптов позволяют проводить скрещивание.
Белки холодового шока борются с образованием кристаллов при низких температурах.
Эти белки важны для выживания при температурах ниже нуля.
При засухе и холоде активируются гены, связанные с холодовым шоком.
Фактор транскрипции AP2/ERF реагирует на холод и засуху.
Специальный элемент отвечает на понижение температуры и засуху.
Глюкокортикоиды используются для регуляции генов в растениях.
Химерный белок связывает глюкокортикоиды и запускает экспрессию генов.
Система не работает без глюкокортикоидов, что предотвращает "подтекание".
Мутанты без волосков используются для изучения регуляции генов.
Генная инженерия компенсирует генетический недостаток.
Обработка дексаметазоном вызывает образование волосков на листьях.
Эстрогены человека используются для индукции генов.
Глюкуронидаза служит репортером для оценки экспрессии генов.
Этанол используется для быстрой индукции генов в растениях.
Фактор транскрипции ZAP запускает ген алкогольдегидрогеназы.
Этанол вызывает линейную экспрессию генов.
Люцифераза светлячка используется для визуализации реакции на этанол.
Белок рецептор тетрациклина связывается с факторами транскрипции.
Тетрациклин вызывает индукцию или выключение генов.
Репортерная линия реагирует на присутствие тетрациклина.
Метод выключения генов, открытый в 1978 году Полем-Замечником.
Смысловая и антисмысловая РНК образуют двойную спираль, которая уничтожается клеткой.
Достаточно небольшого участка гена для антисенс-косупрессии.
Промоутер пришивается к кодирующей части гена для создания антисмысловой РНК.
Антисмысловая РНК уничтожает смысловую РНК, блокируя синтез белка.
Сайленсинг используется для выключения активных генов.
Антисмысловые олигонуклеотиды блокируют синтез белка.
Рибозимы разрезают РНК, предотвращая синтез белка.
Малые интерферирующие РНК разрушают РНК, блокируя синтез белка.
Сайленсинг впервые обнаружен на петунии для борьбы с вирусами.
Малые интерферирующие РНК блокируют транскрипцию и деградацию РНК.
Сайленсинг может охватывать целые растения и органы.
Сайленсинг используется для изменения структуры и биохимии растений.
Примеры: изменение структуры цветка и биохимии хризантемы.
Разрабатываются пестициды на основе малых интерферирующих РНК.
Сайленсинг эффективен против насекомых, грибов и вирусов.
Проблемы: устойчивость насекомых и необходимость стабилизации РНК.
Перспективы: борьба с вирусами и грибами, но не все насекомые чувствительны.
Технология разрушения белкового продукта.
Пример: деградация факторов ауксина для регуляции транскрипции.
Взаимодействие с системой убиквитинирования для деградации белков.
Venus - вариант желтого флюоресцентного белка, который быстро деградирует.
Декрон D2 позволяет Venus быстро деградировать.
Контроль показывает, что стабилизированный домен D2 не взаимодействует с Tyr1.
В начале геоиндукции Venus равномерно распределен в ядрах.
Через 30 минут ядра на нижней стороне перестают светиться, что указывает на перетекание ауксина.
Контроль показывает, что Venus не деградирует даже через 120 минут.
Модификации белка Tyr1 для реакции на модифицированные молекулы.
Добавление D2 к белку интереса вызывает его деградацию при наличии модифицированной молекулы.
Система используется для деградации белков в разных частях организма.
Компонент Cas9 взаимодействует с гидовой РНК и ДНК.
Добавление ауксина вызывает деградацию комплекса, что приводит к яркому свечению ядер.
Аналогичные системы используются для отслеживания концентраций гиберелина и жасмоната.
Рекомбинация используется для полного удаления генов.
Фаговая система и система дрожжей позволяют вырезать ненужные последовательности.
Это важно для удаления последствий генной инженерии и генетического мусора.
Технология увеличивает продажи семян, привязывая фермеров к производителю.
Включает индуцибельную тетрациклином систему и рекомбиназу флипазу.
При обработке тетрациклином удаляется спейсер, что приводит к гибели зародыша.
Использование токсинов для уничтожения групп клеток.
Пример с токсином дифтерии, который вызывает отмирание цветков.
Система барназа-барстар позволяет отменить генетическую хирургию.
Важна для селекционеров для удобства скрещиваний.
Возможность получения фертильных растений из семян с мужской стерильностью.
Выделен ген, экспрессирующийся в эдотециуме у пыльников гороха.
Ген перенесен в пеларгонию зональную, что привело к отмиранию тканей пыльника.
Для отмены действия барназы используется ген барназе старвейшн.
Две линии: одна продуцирует пыльцу, другая стерильна.
Совместная экспрессия барста и барназы приводит к восстановлению мужской стерильности.
Этот подход используется для создания искусственных линий с мужской стерильностью.
Широко используется система CRISPR-Cas9.
Cas9 связывается с гидовой РНК и вносит одноцепочечные разрывы в ДНК.
Cas9 можно модифицировать для различных целей, включая отслеживание событий в геноме и модификацию генома.
Система цинковых нуклеаз на основе факторов транскрипции.
Система таллин-транскрипшн-активатор-эффектор нуклеазы.
Эти системы сложны в сборке и тестировании, но могут использоваться для редактирования генома.
Гомологичная репарация у растений встречается редко.
Для повышения вероятности используют методы, такие как неинфекционный репликон и генную пушку.
Эти методы позволяют внедрять новые последовательности в геном.
Система удобна для редактирования генома и визуализации процессов.
Cas9 используется для нокаута генов и вставки новых последовательностей.
Дополнительные домены химерных белков позволяют включать и выключать гены и визуализировать их активность.
Нокауты используются для изменения метаболизма растений.
Изучают метаболизм и направляют его в нужную сторону с помощью редактирования генома.
Примеры: удаление белкового фактора для увеличения накопления метаболита Ф.
Ферменты могут быть ингибированы или активированы транскрипционными факторами.
Нокаут помогает снять ингибирование и ускорить метаболизм.
Использование микро-РНК для выключения конкурирующих ферментов.
Строятся математические модели для изучения метаболизма.
Инжиниринг метаболизма хорошо работает в прокариотических системах.
В растениях метаболизм сложнее, но успехи есть.
Работа над продукцией вторичных метаболитов и лекарственных соединений.
Пример с томатами: изменение цвета и накопление каротиноидов.
Нокаут генов для увеличения витаминной ценности томатов.
Использование системы CRISPR для исправления мутаций.
Пример с мутантом по кортиноид изомеразе: восстановление нормального цвета томатов.
Система CRISPR позволяет исправлять мутации в геноме.
Использование системы CRISPR для замены нуклеотидов.
Прицельная замена нуклеотидных пар для изменения последовательности.
Методы молекулярной биологии постоянно обновляются.
Уничтожение групп клеток для генетической хирургии.
Пример с токсином дифтерии для уничтожения цветков.
Использование системы барназа-барстар для отмены генетической хирургии.
Получение мужской стерильности у растений для селекции.
Возможность отмены мужской стерильности для получения фертильных растений.
Выделен ген из гороха, экспрессирующийся в пыльниках.
Ген перенесен в пеларгонию зональную, что привело к отмиранию тканей пыльника.
Для отмены действия барназы используется ген барназе старвейшн.
Две линии: одна продуцирует пыльцу, другая стерильна.
Совместная экспрессия барста и барназы восстанавливает мужскую стерильность.
Подход используется для создания искусственных линий с мужской стерильностью.
Система CRISPR-Cas используется для редактирования генома.
Cas9 вносит одноцепочечные разрывы в ДНК.
Cas9 можно модифицировать для различных целей, включая отслеживание событий в геноме.
Система цинковых пальцев использует белки с цинковыми пальцами для узнавания последовательностей.
Система TALEN использует повторы и гипервариабельные аминокислоты для узнавания нуклеотидов.
Обе системы сложны в сборке и тестировании.
Преобладает негомологичное сшивание концов.
Гомологичная репарация встречается редко, но используется для нокаута генов.
Для повышения вероятности гомологичной репарации используются методы, такие как генной пушки.
Система удобна для редактирования и визуализации генома.
Cas9 используется для нокаута генов и вставки новых последовательностей.
Дополнительные домены химерных белков позволяют включать и выключать гены, а также визуализировать их активность.
Нокауты используются для изменения метаболизма растений.
Изучают цепочку метаболитов и целевой продукт.
Воздействуют на ферменты с помощью редактирования генома.
Обратная отрицательная связь и ингибирование ферментов.
Нокаут для снятия ингибирования и ускорения метаболизма.
Экспрессия активаторов транскрипции для увеличения ферментов.
Строятся математические модели для изучения метаболизма.
Инжиниринг метаболизма эффективен в прокариотических системах.
В растениях подход менее развит, но успехи есть.
Модельная система: созревание плодов томатов.
Регулирование ферментов для изменения цвета томатов.
Нокаут генов для увеличения витаминной ценности томатов.
Использование системы репликации гемини-вирусов.
Исправление мутаций с помощью системы CRISPR-Cas.
Прицельная замена нуклеотидов для тонкой работы с геномом.
Методы молекулярной биологии постоянно обновляются.
Исследования в других системах применяются на растениях.
Основные методы для исследования генома растений и получения практических результатов.