Геномное секвенирование: как и зачем?

• Лекция посвящена геномному секвенированию.  

• Гость - Марсель Расимович Кабилов, руководитель центра коллективного пользования геномики.  

• Тема лекции: как и зачем секвенировать геномы.  

• Древо жизни включает прокариоты, бактерии, археи, вирусы и эукариоты.  

• Геном - базовая категория для описания живого существа.  

• Хромосомы состоят из ДНК, которая состоит из нуклеотидов.  

• Выделение ДНК из различных объектов.  

• Фрагментация хромосом при выделении ДНК.  

• Получение набора фрагментов ДНК длиной от 10 до 40 килобаз.  

• Зонд для считывания нуклеотидов в ДНК.  

• Проблема хаотичного движения молекул ДНК в растворе.  

• Необходимость разделения молекул ДНК для точного считывания.  

• Разделение молекул ДНК в пространстве с помощью планшетов.  

• Разделение молекул ДНК во времени с помощью зондов.  

• Использование контиливеров для сканирования поверхности ДНК.  

• Чувствительность зондов ограничена.  

• Технология не получила развития из-за технических ограничений.  

• Геномное секвенирование выполняется с использованием других методов.  

• Физическая фрагментация с использованием ультразвука и небуляции.  

• Гидродинамическая фрагментация и использование ферментов.  

• Транспозаза как фермент, который фрагментирует и присоединяет адаптеры.  

• Присоединение нуклеотидных последовательностей с помощью ДНК-аллигазы.  

• Три поколения геномного секвенирования: планшеты, микрочипы, портативные устройства.  

• Амплификация фрагментов с помощью ПЦР.  

• Использование планшетов для разделения фрагментов ДНК.  

• Трансфекция плазмид в бактерии и их репликация.  

• Выделение плазмидной ДНК и получение планшета с индивидуальными фрагментами.  

• Бридж ПЦР твердофазный ПЦР на чипе.  

• Моноклональная амплификация не требует амплификации, так как работает с одиночными молекулами.  

• Секвенирование фрагментов ДНК происходит параллельно с их изоляцией.  

• Используются три основных метода: ДНК-полимераза, ДНК-газ и мембранный белок.  

• ДНК-полимераза взаимодействует с двухцепочечной ДНК и встраивает комплиментарные нуклеотиды.  

• Для работы ДНК-полимеразы используются адаптеры и праймеры.  

• Встраивание меченых нуклеотидов создает сигналы, которые можно прочитать для восстановления последовательности.  

• В процессе синтеза ДНК добавляются специфичные нуклеотиды, которые обрывают цепь при встраивании.  

• Фрагменты ДНК разделяются с помощью электрофореза и считываются с помощью детектора.  

• Полученная стенограмма пиков позволяет восстановить нуклеотидную последовательность.  

• Персиквенирование использует добавление нуклеотидов по одному, что позволяет наблюдать сигналы люминесценции.  

• Технология основана на эмульсионной ПЦР и полупроводниковом чипе.  

• Изменение потенциала на чипе позволяет детектировать встраивание нуклеотидов.  

• Платформа Illumina использует твердофазную ПЦР и считывает метки с поверхности чипа.  

• После встраивания одного нуклеотида, метка удаляется, и процесс повторяется.  

• Платформа позволяет считывать сигналы от каждого кластера на чипе.  

• Платформа работает с одиночными молекулами и использует нано-колодцы на чипе.  

• ДНК-полимераза встраивает нуклеотиды в нано-колодцы, и сигналы считываются лазером.  

• Технология позволяет читать до 15 тысяч нуклеотидов и распознавать модификации ДНК.  

• ДНК-лигаза образует фосфодиэфирные связи в двухцепочечных участках ДНК.  

• Эффективность лигирования снижается при наличии нуклеотидных несоответствий.  

• Технология ДНК-наболов использует праймеры и зонды для лигирования и считывания последовательности ДНК.  

• Праймеры и зонды гибрилизуются с ДНК, образуя фосфодиэфирные связи при наличии комплиментарных пар.  

• Флюоресцентные метки позволяют сканировать чип и определять последовательность ДНК.  

• Процесс повторяется для считывания последовательности с шагом плюс один.  

• Фирма, разработавшая технологию, купила компанию, использующую ДНК-лигазу.  

• Существует подозрение, что они используют капсираза вместо ДНК-лигазы.  

• Китайская платформа предлагает широкий диапазон объемов данных от 24 ГБ до 6 ТБ.  

• Мембранные белки считывают сигнал с исходной молекулы ДНК без необходимости её комплификации.  

• Принцип работы: одноцепочечная ДНК проходит через пору, взаимодействуя с адаптерной последовательностью.  

• Изменение потенциала позволяет идентифицировать модифицированные нуклеотиды и читать длинные последовательности.  

• Стоимость секвенирования одной мегабазы снизилась с 10 миллионов долларов до 1000 долларов.  

• Снижение стоимости секвенирования генома человека также произошло, но с меньшим темпом.  

• Вложение в разработку технологий секвенирования привело к значительным снижениям стоимости.  

• Геномное секвенирование используется для классификации новых видов и анализа эволюции.  

• ДНК-баркотинг позволяет идентифицировать виды по последовательностям генов.  

• Пример: анализ бабочек из Амазонии показал, что они относятся к разным видам.  

• Данные ДНК-баркодинга позволили построить эволюционное дерево.  

• Для каждого типа организмов найдены маркеры, такие как ITS для грибов и растений, 16S рРНК для прокариот, SSU rRNA для животных.  

• Эти маркеры должны быть высоко консервативны внутри популяции и сильно отличаться от других видов.  

• Для крупных многоклеточных организмов секвенирование не вызывает проблем.  

• Для микроскопических объектов, таких как вирусы и бактерии, также можно использовать маркеры.  

• Однако, разные виды могут иметь одинаковую последовательность маркеров, что требует использования нескольких маркеров.  

• Для анализа бактерий используется 120 консервативных генов.  

• Секвенирование 120 генов вручную утомительно и дорого.  

• Для идентификации бактерий и вирусов часто используется секвенирование всего генома.  

• Вирусы имеют самые маленькие геномы, до 1 мегабазы.  

• Бактерии имеют геномы до 10 мегабаз.  

• Грибы и млекопитающие имеют геномы от 10 мегабаз до 10 гигабаз.  

• После выделения ДНК проводится фрагментация и присоединение адаптеров.  

• Полученная библиотека сканируется на геномноматоре, и из прочтений собирается континент.  

• Важно понимать, что процесс не всегда прост и зависит от используемых платформ.  

• У эукариот растет количество некодирующей ДНК, что усложняет сборку генома.  

• У человека 98% генома некодирующая ДНК, что делает секвенирование неэффективным для филогенетики.  

• Длинные последовательности помогают избежать проблем с повторами и ошибками.  

• Для эукариот используются различные методы, такие как диссекция хромосом и сортировка.  

• Эти методы помогают изолировать фрагменты библиотек друг от друга.  

• Технология баки-яки позволяет секвенировать целые хромосомы, что упрощает сборку генома.  

• Микрофлюидная система позволяет добавлять ДНК-фрагменты на микрошарики.  

• Праймеры на микрошариках создают библиотеку, которая несет баркод для каждого фрагмента.  

• Таргетное секвенирование минимизирует стоимость, фокусируясь на целевых участках генома.  

• Мультиплексная ПЦР: подбор наборов праймеров для амплификации нужных участков.  

• Лонч ПЦР: получение длинного ампликона, его фрагментирование и секвенирование.  

• Гипотезирование с олигонуклеотидами: использование зондов для извлечения интересующих участков из библиотеки.  

• Примеры: секвенирование метахондриальных геномов и хлоропластов.  

• Эволюционная геномика: построение филогенетических деревьев.  

• Популяционная геномика: анализ полиморфизма и генов, связанных с заболеваниями.  

• Функциональная геномика: анализ аннотированного генома.  

• Транскриптомика: изучение транскриптома с помощью метода РНК-секвенирования.  

• Удаление рибосомальной РНК: использование деплеции и обогащения.  

• Дифференциальная экспрессия: анализ изменений в экспрессии генов под воздействием лекарств.  

• Секвенирование транслятома: оценка уровня экспрессии белков через рибосек.  

• Метод рибосек: остановка трансляции и секвенирование рибосом.  

• Изучение ДНК-белковых взаимодействий, метилирования ДНК, 3D структуры генома.  

• Метод PARCLIP: изучение взаимодействий белков с РНК.  

• Примеры применения: идентификация вирусов и анализ эпидемй.  

• Методы идентификации вирусов: использование клеточных культур и таргетных панелей.  

• Проблемы секвенирования мазка: необходимость большого покрытия для детекции вируса.  

• Вопросы и ответы по методам секвенирования.