Гладилин А.К. - Введение в специальность - 19. Хроматография и электрофорез

• Лекция посвящена хроматографическому и электролитическому методам очистки белков.  

• Обсуждаются методы фракционирования и осаждения для обогащения целевого фермента.  

• Хроматография использует разделение смесей на индивидуальные компоненты.  

• Хроматография основана на различии в сродстве компонентов смеси к подвижной и неподвижной фазам.  

• Компоненты, склонные к подвижной фазе, завершают процесс раньше.  

• Хроматография классифицируется по подвижной фазе: жидкостная, газовая, бумажная, тонкослойная, колоночная.  

• Классификация по подвижной фазе: жидкостная, газовая, бумажная, тонкослойная, колоночная.  

• Классификация по давлению: низкого, высокого.  

• Классификация по типу сродства: адсорбция, ионный обмен, распределительная хроматография.  

• Колонка с носителем, который должен быть под слоем жидкости.  

• Процесс уравновешивания колонки для оптимального распределения носителя.  

• Важность размера частиц носителя и их влияние на гидродинамическое сопротивление.  

• Адаптер, шланг, насос, емкость для жидкости.  

• Регистратор для измерения оптической плотности в ближнем ультрафиолете.  

• Коллектор фракций и регистратор ферментативной активности.  

• Гель-фильтрация: подвижная фаза жидкость, неподвижная фаза пористые гранулы.  

• Адсорбционная хроматография: подвижная фаза жидкость, неподвижная фаза твердые тела.  

• Распределительная хроматография: обе фазы жидкости, коэффициент распределения.  

• Ионообменная хроматография: подвижная фаза жидкость, неподвижная фаза твердое тело, электростатические взаимодействия.  

• Аффинная хроматография использует биологическое сродство для разделения веществ.  

• Примеры: фермент-ингибитор, антиген-антитело, гормон-рецептор.  

• Обсуждение различных типов хроматографии, начиная с гель-фильтрации.  

• Гранулы имеют поры, что создает внутренний и внешний объемы.  

• Маленькие молекулы движутся внутри гранул, а большие молекулы остаются снаружи.  

• Эффективность разделения зависит от доступности внутреннего объема для молекул разного размера.  

• Эффективность разделения белков зависит от скорости элюции и длины колонки.  

• Слишком высокая скорость не позволяет белкам разделиться, а слишком низкая приводит к уширению пиков.  

• Ширина колонки также влияет на разделение, но узкие колонки предпочтительнее для разделения белков.  

• Важны пористость носителя и размер гранул.  

• Слишком мелкие гранулы создают сопротивление и замедляют процесс.  

• Гель-фильтрация требует оптимизации по многим параметрам для успешного разделения.  

• Препаративная: обессоливание, смена буфера, разделение белков.  

• Аналитическая: определение молекулярной массы белков с помощью белков-маркеров.  

• Проблемы с калибровкой из-за формы белков, решается денатурацией.  

• Подвижная и неподвижная фазы могут быть жидкостями.  

• Гранулы могут быть смачены водой или неполярным органическим растворителем.  

• Компоненты смеси различаются по коэффициенту распределения и гидрофильности/гидрофобности.  

• Ионообменная хроматография использует заряженные группы на гранулах для разделения белков.  

• Противоположно заряженные группы притягиваются, а разноименно заряженные - нет.  

• Ионообменники делятся на катионные и анионные, сильные и слабые.  

• Сильные ионообменники заряжены в широком диапазоне pH.  

• Слабые ионообменники заряжены в узком диапазоне pH.  

• Примеры сильных и слабых ионообменников: карбоксильная группа и диэтил амин.  

• Графики показывают долю заряженных групп в зависимости от pH.  

• Сильные ионообменники имеют широкий диапазон заряженных групп.  

• Слабые ионообменники имеют более узкий диапазон заряженных групп.  

• Слабые ионообменники используются чаще для предотвращения денатурации белков.  

• Правильный подбор носителя и pH позволяет избежать денатурации.  

• Ионообменная хроматография состоит из двух этапов: посадка и элюция.  

• Посадка: подбор pH для оптимального связывания белка с колонкой.  

• Элюция: изменение pH или ионной силы для снятия белка с колонки.  

• Градиентная элюция используется для лучшего разделения белков.  

• Градиентная элюция может быть ступенчатой или линейной.  

• Линейный градиент позволяет белкам выходить при разных концентрациях.  

• Проверка активности белка помогает выбрать правильную фракцию для анализа.  

• Линейный градиент создается с помощью миксера и двух емкостей с растворами.  

• Раствор 0.1-молярного натрия хлорида наливается в одну емкость, а 1-молярного - в другую.  

• Смесь выходит из миксера, постепенно приближаясь к 1-молярному раствору.  

• Аффинная хроматография использует биологическое сродство для очистки ферментов.  

• Целевой фермент связывается с ингибитором на колонке, а затем снимается агентом.  

• Метод позволяет получить чистый фермент за одну стадию.  

• Создание аффинных колонок требует много времени и усилий.  

• Важно подобрать правильное расстояние между ингибитором и колонкой.  

• В некоторых случаях лучше использовать стандартные методы для получения чистого фермента.  

• Групповая аффинность позволяет разделять белки по определенным признакам.  

• Пример: лектиновый центр на колонке может связывать гликопротеины.  

• Это может быть полезно для очистки ферментов с групповой аффинностью.  

• Электрофорез основан на взаимодействии белков с электрическим полем.  

• Белки движутся в зависимости от их заряда и pH среды.  

• В реальной системе диффузия мешает четкому разделению белков.  

• Гель электрофорез использует гель с полимерными цепочками для разделения белков.  

• Белки движутся через гель, натыкаясь на полимерные цепочки.  

• Скорость движения белков зависит от их заряда, молекулярной массы и формы.  

• Гель электрофорез используется для препаративного и аналитического разделения белков.  

• Препаративное разделение позволяет выделять белки из геля.  

• Аналитическое применение включает определение молекулярной массы и степени гомогенности белков.  

• Белки различаются по форме, что усложняет определение их молекулярной массы.  

• Нативный электрофорез используется для определения молекулярной массы белков.  

• Денатурирующий электрофорез позволяет более точно определить молекулярную массу.  

• Денатурирующий электрофорез с денатурирующими агентами, такими как додецилсульфат натрия, разворачивает белки.  

• Гидрофобные участки белков выходят на поверхность, что делает их более подвижными.  

• Денатурирующие агенты создают конгруэнтные фигуры с одинаковыми свойствами, что позволяет точнее определить молекулярную массу.  

• В гель-фильтрации белки с большей молекулярной массой выходят первыми, а в гель-электрофорезе — наоборот.  

• В гель-электрофорезе белки движутся внутри геля, а в гель-фильтрации — вне гранул.  

• Это различие позволяет более точно определить молекулярную массу белков.  

• Изоэлектрофокусирование использует олигомеры, которые различаются по количеству заряженных групп.  

• Олигомеры поддерживают вокруг себя определенный pH, создавая градиент pH.  

• Белки с разным зарядом движутся к соответствующему pH, создавая шкалу pH.  

• Изоэлектрофокусирование позволяет определить изоэлектрическую точку белка.  

• Это важно для ионообменной хроматографии и очистки белков.  

• Метод используется в аналитических целях для характеристики белков и определения их гомогенности.  

• Изоэлектрофокусирование создает узкие полосы, что позволяет точнее определить белки.  

• Существуют различные методы, включая хроматографию и седиментацию, для очистки белков и ферментов.  

• Методы подбираются в зависимости от требуемой степени очистки или выхода продукта.