Основы ВЭЖХ. Жидкостная хроматография высокого давления. Часть 1

• Антон Лебедев представляет модуль по жидкостной хроматографии.  

• Рассматриваются вопросы классификации высокоэффективной жидкостной хроматографии ВЭЖХ.  

• Обсуждаются асорбционная, нормально-фазовая, обращенно-фазовая и хили-хроматография.  

• Классификация хроматографии включает асорбционную, нормально-фазовую, гидрофильную, обращенно-фазовую, ионообменную и аффинную хроматографию.  

• В этом модуле будут рассмотрены первые четыре типа хроматографии.  

• Асорбционная хроматография использует полярный сорбент силикагель и неполярную подвижную фазу с полярными добавками.  

• Силикагель может сорбировать воду, что снижает его сорбционные характеристики.  

• Недостатки асорбционной хроматографии включают гидратацию силикагеля и длительное уравновешивание колонки.  

• Нормально-фазовая хроматография использует модифицированный силикагель с полярными группами.  

• Это частично защищает от гидратации, но требует контроля содержания воды в растворителях.  

• Нормально-фазовая хроматография менее распространена, чем обращенно-фазовая.  

• Хили-хроматография использует сорбенты нормально-фазовой хроматографии и элюент обращенно-фазовой хроматографии.  

• Применяется для разделения веществ с недостаточной удерживающей способностью для обращенно-фазовой и ионной хроматографии.  

• Элюент содержит больше органического компонента, чем в классической обращенно-фазовой хроматографии.  

• Обращенно-фазовая хроматография использует неполярный сорбент, такой как силикагель с привитыми алкильными или арильными группами.  

• Элюент состоит из воды или раствора кислоты с полярными добавками, такими как ацетонитрил, метанол или пропанол.  

• Высокие значения pH могут вызвать гидролиз сорбента, поэтому рабочий диапазон составляет от 2 до 10 pH.  

• Сила элюента определяется процентным содержанием полярной добавки в подвижной фазе.  

• Чем больше полярной добавки, тем выше сила элюента и быстрее выходит вещество из колонки.  

• Режим работы: изократический или градиентный, где градиентный режим меняет состав элюента в ходе анализа.  

• Состав элюента влияет на разрешение, так как разные соединения лучше смываются разными растворителями.  

• Квалификация оператора важна для подбора состава элюента для достижения нужного разрешения пиков.  

• pH влияет на сорбционные характеристики веществ, особенно на кислотные и основные соединения.  

• Ионная сила буфера теоретически может влиять на селективность, но на практике это не всегда эффективно.  

• Колонка влияет на разрешение через тип сорбента, длину колонки, размер пор и диаметр зернения.  

• Температура влияет на скорость выхода компонентов и их сорбцию, что может изменить порядок выхода пиков.  

• Основные факторы, влияющие на разрешение: сила элюента, состав элюента, pH, ионная сила буфера, колонка, температура и скорость потока.  

• В газовой хроматографии основные факторы: неподвижная фаза и температура, что обеспечивает высокую эффективность разделения.  

• Обзор различных видов жидкостной хроматографии: ионообменная, он-парная, эксклюзионная и аффинная.  

• Сравнение классической высокоэффективной жидкостной хроматографии ВЭЖХ и ультраВЭЖХ.  

• Основные факторы: размер частиц сорбента, размер колонок и скорость потока элюента.  

• В ультраВЭЖХ используются сорбенты с размером частиц менее 2 мкм, в ВЭЖХ - от 3 до 5 мкм.  

• Колонки в ультраВЭЖХ имеют длину менее 100 мм, в ВЭЖХ - более 100 мм.  

• Скорость потока элюента: ВЭЖХ - до 0.5 мл/мин, ультраВЭЖХ - более 0.5 мл/мин.  

• ВЭЖХ требует больше времени для анализа, но обеспечивает лучшее разделение пиков.  

• УльтраВЭЖХ быстрее, но требует более дорогих аксессуаров и системных модулей.  

• Пример хроматограмм для ВЭЖХ и ультраВЭЖХ показывает различия в эффективности разделения.  

• Основные компоненты прибора: поддон с бутылочками для элюентов, вакуумный дегазатор, насос, инжектор, термостат колонок, колонка, детектор, рабочая станция.  

• Опциональные компоненты: предколонка, термостат колонок, рабочая станция.  

• Пример схемы хроматографа Daionics Ultimate 3000.  

• Основные компоненты элюента: вода, буферные растворы, растворы кислот.  

• Примеры добавок: спирты, диокксан, уксусная кислота.  

• Требования к растворителям: высокая чистота, отсутствие взвешенных частиц, прозрачность в ультрафиолете, отсутствие растворимых добавок, низкая вязкость.  

• Давление в системе ВЭЖХ является ключевым диагностическим параметром.  

• Неисправности прибора часто отражаются на давлении в системе.  

• Растворимые примеси критичны для градиентного элюирования.  

• Наличие примесей может привести к появлению пиков подвижной фазы вместо компонентов образца.  

• Ионы и органика могут загрязнять масс-спектрометр и УФ-детектор, увеличивая шум базовой линии.  

• Взвесь снижает эффективность аналитических колонок и сокращает динамический диапазон концентрации.  

• Взвесь быстро приводит к асимметрии и двоению пиков, что требует немедленного устранения.  

• Личный опыт показывает, что отсутствие фильтрации приводит к проблемам с прибором.  

• Основной компонент элюента – вода, желательно нулевого типа.  

• Вода должна иметь удельное сопротивление 18.2 МОм/см или удельную электропроводность 55 мкСм/см.  

• Общий органический углерод должен быть менее 5 млрд. долей.  

• Фильтрация элюентов и компонентов элюента обязательна для удаления взвеси.  

• Фильтрация через фильтр Шотта и фильтрующие насадки помогает удалить грубую взвесь и дегазировать подвижную фазу.  

• Для фильтрации бактерий используются мембраны или насадки диаметром не более 0.1-0.2 мкм.  

• Дегазация удаляет воздух из системы, предотвращая интерференцию пиков и скачки давления.  

• Используются вакуумный дегазатор, перегонка, барбатирование гелием или ультразвуковая ванна.  

• Встроенный вакуумный дегазатор удаляет газы с помощью вакуума и пористой мембраны.  

• Встроенный вакуумный дегазатор не решает проблему растворенных газов.  

• Он доводит компоненты до требуемой кондиции, но не справляется с большим количеством газов.  

• Рекомендуется проводить ручную догазацию при большом количестве растворенных газов.  

• Пузырек воздуха в мертвом объеме может вызвать ложные сигналы на детекторе.  

• Воздух оседает на сорбенте колонки, что требует длительного кондиционирования.  

• Лучше предотвращать попадание воздуха в систему, чтобы избежать проблем.  

• Воду следует очищать от органических компонентов, используя перманганат калия и серную кислоту.  

• Процесс включает кипячение и добавление перманганата до осветления раствора.  

• После кипячения воду подщелачивают и перегоняют.  

• Проводят дистилляцию, деонизацию и очистку от взвешенных частиц.  

• Фильтрация зависит от степени загрязнения воды.  

• Дегазация и догазация необходимы для органических растворителей.  

• pH элюента определяет селективность разделения.  

• Используют буферные растворы для контроля pH.  

• Для кислот и оснований выбирают pH, близкий к их pK.  

• Бензиламин протонируется при кислых pH, что ухудшает его удерживание.  

• Изменение pH влияет на порядок выхода соединений.  

• Сила элюента определяется концентрацией полярной добавки.  

• Колонки должны выдерживать высокие давления и иметь минимальный мертвый объем.  

• Предколонка принимает на себя загрязнители и механические примеси.  

• Рекомендуется использовать предколонку для защиты основной колонки.  

• Длина и внутренний диаметр колонки определяют количество теоретических тарелок и емкость колонки.  

• Внутренний диаметр также влияет на количество сорбента в колонке.  

• Тип сорбента, размер зерен и размер пор также важны для эффективности разделения.  

• Проверка хроматограммы тестовой смеси и давления на колонке.  

• Давление является диагностическим признаком, указывающим на проблемы в системе.  

• Ведение журнала учета давления помогает выявить и устранить неисправности.  

• Полярные сорбенты используются в нормальной фазовой хроматографии.  

• Неполярные сорбенты применяются в обращенно-фазовой хроматографии.  

• Ионно-обменные и смешанные сорбенты используются для селективного разделения ионогенных соединений.  

• Фазовый коллапс происходит при высоком содержании воды в элюенте.  

• Сорбент деформируется из-за гидрофобного взаимодействия с водой.  

• Современные технологии позволяют контролировать гидрофобные взаимодействия и минимизировать фазовый коллапс.  

• Традиционная защита три-метилсилильная группа.  

• Модификация силанольного фрагмента изопропильной или трет-бутильной группой.  

• Полярная защита и модификация для предотвращения отклонения сорбента.  

• Меньший диаметр зерен улучшает разделение, но требует более высокого давления.  

• Диаметр пор влияет на размер молекул, которые колонка может пропускать и задерживать.  

• Для анализа белков диаметр пор должен быть не менее 300 ангстрем.  

• Выбор зависит от растворимости сорбата в полярных или неполярных растворителях.  

• Обращенно-фазовая хроматография является наиболее часто применяемой.  

• Заключение: обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография является важным инструментом в аналитических работах.