"Вестерн-блоттинг" Заседание СНК от 21.12.2021

• Иммуноблотинг, или вестерн-блотинг, используется для определения специфических белков в образцах.  

• Метод включает разделение белков с помощью гель-электрофореза и детекцию нужного белка с помощью антител.  

• Применяется в биохимии, молекулярной биологии и иммунологии.  

• Название "вестерн" связано с методом Саузерн-блотинга для определения ДНК.  

• Первый этап - электрофорез, включающий подготовку образцов и измерение концентрации белка.  

• Электрофорез белков - метод разделения белков под действием электрического тока.  

• Нативный электрофорез разделяет белки по размеру, а денатурирующий - с использованием SDS.  

• Электрофорез в денатурирующих условиях чаще используется в вестерн-блотинге.  

• Электрофоретическая подвижность белков зависит от их молекулярной массы.  

• Полиакриламидный гель состоит из акриламида и бисакриламида.  

• Формирующий гель концентрирует образец, а разделяющий гель разделяет белки.  

• Концентрация полиакриламида зависит от размера белков.  

• SDS денатурирует белки и уничтожает их заряд, что позволяет разделять белки по молекулярной массе.  

• Градиент pH концентрирует белки на границе геля, повышая разрешающую способность.  

• Камера для электрофореза позволяет загружать образцы и включать ток для разделения белков.  

• Для покраски геля используется кумаси бриллиантовый синий, который выпускается в двух конфигурациях.  

• Двойной прогон позволяет улучшить разделение белков в районе определенной молекулярной массы.  

• Гель отмывается раствором уксусной кислоты и хранится в менее концентрированном растворе.  

• Перенос белков с геля на мембрану называется блотингом.  

• Используются нитроцеллюлозные и ПВДФ мембраны.  

• Перенос происходит с помощью сэндвич-метода, инкубация длится около 16 часов.  

• После переноса белков на мембрану, её нужно заблокировать.  

• Для блокировки используются бычий сывороточный альбумин или сухое молоко  

• Первичные антитела не метятся, так как используется непрямой метод.  

• Вторичные антитела могут быть модифицированы с биотином для создания комплекса со стрептоидином и ферментами.  

• Биотин позволяет конъюгировать широкий спектр ферментов, что упрощает процесс.  

• Использование антител с готовым ферментом, таким как пероксидаза хрена или алкалиновая фосфатаза.  

• Антитела с флуоресцентной меткой для детекции в флуоресцентном микроскопе.  

• Антитела с радиоактивной меткой, но этот метод менее безопасен.  

• Субстраты для пероксидазы хрена и алкалиновой фосфатазы: бензидин и бисип соответственно.  

• Детекция люминесценции и калориметрическое измерение количества белка.  

• Использование сканера для измерения хемилюминесценции и изменения окраски.  

• Разделение белков по двум параметрам: изо-электрическое фокусирование и гель-электрофорез.  

• Изо-электрическая точка: значение pH, при котором заряд молекулы равен нулю.  

• Градиент pH от 3 до 10 используется для остановки молекул в нужной точке.  

• Метод для анализа содержания белка в отдельных клетках.  

• Использование геля с порами для лизиса клеток и последующего электрофореза.  

• Возможность соединения белков с флуорохромами для детекции по испусканию света.  

• Методики постоянно развиваются для улучшения разделения и детектирования белков.  

• Удачных блатов!