Обработка микроскопических изображений. Лекция 1

• Курс не ограничен учебной программой и может быть изменен по ходу.  

• Практические занятия будут ограничены раздачей задач и картинок.  

• Первые четыре лекции будут простыми для начинающих.  

• Зачем документировать изображения и почему нельзя их перерисовывать.  

• Получение изображений на обычной камере и важность правильного снятия.  

• Ошибки при получении изображений усложняют их обработку.  

• Кодекс обработки изображений с 1998 года.  

• Методы улучшения контраста и пространственной конволюции.  

• Цветовая деконволюция для разделения каналов изображения.  

• Пространственная и яркостная калибровка изображений.  

• Подсчет объектов и сегментация изображений.  

• Традиционная морфометрия и описательные характеристики формы.  

• Работа с многоканальными и цветными изображениями.  

• Использование макросов для автоматизации обработки изображений.  

• Примеры макросов для обработки и сохранения объектов.  

• Визуализация трехмерных объектов и разница между проекцией и реконструкцией.  

• Проблемы сегментации изображений и использование программы Fiji.  

• Специальные программы для подготовки изображений к публикации.  

• Проблемы хранения и обработки изображений при работе с несколькими людьми.  

• Важность специальных информационных систем для работы с большими объемами данных.  

• Возможность добавления новых тем по запросу участников.  

• Традиционная морфометрия: анализ длин, ширины, площади и периметра.  

• Геометрическая морфометрия на основе опорных точек и матриц.  

• Морфометрия контуров и ссылки на программное обеспечение для работы с этими методами.  

• Используется для повторяющихся структур, таких как крылья насекомых.  

• Выделяются опорные точки, которые могут различаться у разных видов.  

• Создается карта деформации для сравнения объектов.  

• Применяется метод главных компонент для классификации видов.  

• Используется для анализа контуров реальных объектов.  

• Выделяются значимые характеристики, такие как расширение зуба.  

• Описываются изменения контуров по различным компонентам.  

• Бесплатные программы для морфометрии контуров не найдены, но есть платные.  

• Зрение не является точным измерительным прибором.  

• Оптические иллюзии мешают достоверной оценке размеров и яркости.  

• Примеры иллюзий: восприятие размеров объектов и параллельности линий.  

• Мозг обрабатывает изображение с учетом теней, что влияет на восприятие яркости.  

• Иллюзии восприятия цвета, например, на картине Клода Моне.  

• Эволюционные системы восприятия делят информацию на "что" и "где".  

• Иллюзия движения: неподвижная картинка кажется движущейся.  

• Адаптация глаза: исчезновение одной из точек воспринимается как сигнал.  

• Мозг вычитает погрешности фона, что влияет на восприятие изображения.  

• Цвет субъективен и зависит от окружения.  

• Восприятие цвета связано с возбуждением колбочек в глазу.  

• Окружение влияет на восприятие цвета.  

• Восприятие цвета зависит от предыдущего опыта.  

• Оптические иллюзии, такие как лица на картинах, могут быть вызваны опытом.  

• Глаз не является точным измерительным инструментом.  

• Глаз не может количественно оценивать изображения.  

• Необходимы системы документации для нивелирования особенностей зрения.  

• Важно обсуждать способы получения и сохранения изображений.  

• Использование счетной сеточки для перерисовки изображений.  

• Камера Люсида позволяет видеть препарат и бумагу софокусно.  

• Перерисовка позволяет избежать геометрических искажений.  

• Цифровые камеры используются для получения изображений.  

• Телесистемы позволяют изменять увеличение для съемки.  

• Возможность изменения увеличения важна для соблюдения разрешения.  

• Дисторсия бочка и подушка влияет на измерение клеток.  

• Неполное кадрирование и использование объективов с пометкой план могут минимизировать дисторсию.  

• Проверка объективов с помощью микролинейки необходима для минимизации дисторсии.  

• Хроматическая аберрация влияет на качество изображения, особенно при колокализации.  

• Преломление света зависит от длины волны, что приводит к разному фокусу для разных цветов.  

• Это может искажать изображение и мешать морфометрии.  

• Хроматическая аберрация может привести к тому, что сигналы от разных каналов не пересекаются.  

• Это может привести к неправильной оценке колокализации.  

• Проблема может быть выражена по глубине и плоскости препарата.  

• Для проверки колокализации можно использовать специальные шарики.  

• Если проблема есть, можно использовать другой объектив или сдвинуть каналы.  

• Важно использовать многоцветные шарики для точной колокализации.  

• Изображение формируется оптической системой, а не квадратами.  

• Яркость распределяется по функции распределения точки.  

• Точки изображения на камере могут не совпадать с оптическими точками.  

• Разрешение микроскопа ограничено минимально-дефракционно ограниченной точкой.  

• Если камера сдвинута, точки могут оказаться в разных местах.  

• Важно сопоставлять разрешение оптической системы и камеры для точных измерений.  

• Размер матрицы и количество мегапикселей.  

• Разрядность: количество яркости, которое может увидеть камера.  

• Человеческий глаз различает от 60 до 120 оттенков яркости.  

• Черно-белая картинка может различать 120 оттенков.  

• Для выделения мало светящихся объектов требуется большая разрядность.  

• Увеличение разрядности улучшает качество обработки изображения.  

• Важность соотношения данных с реальными единицами измерения.  

• Пример: GPS-координаты и параметры камеры в формате JPEG.  

• Необходимость описания геометрических и яркостных искажений.  

• Возможность создания стеков изображений для анализа.  

• Примеры: изменение параметров съемки по времени или каналам.  

• Многомерная микроскопия: увеличение параметров одновременно.  

• Пиксель изображения не является точной копией исходной точки.  

• Важность правильного выбора разрешения камеры.  

• Примеры неправильного выбора параметров съемки.  

• Пиксель изображения не является точной копией точки.  

• Масштабирование изображения может привести к артефактам.  

• Пример: уменьшение изображения без размытия приводит к муаровым полосам.  

• Объяснение функции распределения точки в объеме.  

• Вопрос о количестве точек камеры для разрешения двух точек.  

• Пример с одной точкой камеры на каждую точку изображения.  

• Проблема с одной точкой камеры на каждую точку изображения.  

• Необходимость в два раза большего количества точек для сохранения разрешения.  

• Теорема Котельникова и критерий Найквиста.  

• Использование деконволюции для увеличения контрастности.  

• Рекомендация брать в три раза больше точек камеры для высокоразрешающих работ.  

• Пример с четырьмя точками камеры на одну оптическую точку.  

• Пример с объективом и длиной волны света.  

• Расчет размера центрального пятна ири.  

• Определение количества оптических точек на поле зрения микроскопа.  

• Расчет необходимого разрешения камеры для сохранения разрешения.  

• Пример с 200 точками камеры по икс и 1500 точками по игрек.  

• Использование калькулятора для расчета разрешения.  

• Влияние увеличения и числовой апертуры на размер точки.  

• Пример с десятикратным объективом и большой числовой апертурой.  

• Пример со стократным объективом и средней числовой апертурой.  

• Влияние битности камеры на качество изображения.  

• Рекомендация использовать 8-битную камеру для работы с изображениями.  

• Важность 12-битного разрешения для сохранения яркости изображения.  

• Обсуждение метаданных, размера точки и яркости.  

• Важность сохранения всех этих параметров.  

• Формирование требований к формату файлов для микроскопа.  

• Два типа сжатия: без потерь и с потерями.  

• Сжатие с потерями приводит к изменению значений точек.  

• Запрет на использование форматов JPEG, PNG и TIFF.  

• TIFF удобен для работы, так как позволяет сохранять изображения без сжатия.  

• Возможность добавления метаданных и текстовых файлов.  

• Поддержка различных разрядностей и нескольких каналов.  

• TIFF является открытым форматом, доступным на любом компьютере.  

• Коммерческие форматы, такие как Leica и Zeiss, основаны на TIFF.  

• Возможность сохранения необработанных данных и цифровой подписи приборов.  

• OMI-TIFF содержит все необходимые заголовки и метаданные.  

• Возможность чтения и сохранения изображений без специального ПО.  

• Поддержка калибровки и сохранения метаданных при открытии на другом компьютере.  

• Два типа камер: ПЗС и CMOS.  

• ПЗС-матрицы имеют высокую квантовую эффективность.  

• CMOS-матрицы могут накапливать сигнал и улучшать чувствительность.  

• ПЗС-матрицы могут накапливать заряд и считывать его группами точек.  

• Это увеличивает площадь съемки и уменьшает шум.  

• Матрицы с накоплением могут накапливать изображение и считывать его построчно.  

• Блуминг возникает при слишком высокой выдержке.  

• Вертикальные и горизонтальные полосы указывают на проблему с выдержкой.  

• Уменьшение времени экспозиции помогает избежать блуминга.  

• Кноп-матрицы имеют участки, накапливающие свет, и усилители.  

• Позволяют считывать любую точку изображения в любой момент времени.  

• Современные CCD-матрицы также имеют опции для чтения регионов интереса, но медленнее.  

• Новые матрицы SIMMOS приближаются по параметрам к CCD-матрицам.  

• Дешевле и быстрее в использовании.  

• Позволяют сканировать только нужные участки образца.  

• Камеры с качающимся затвором могут создавать размытые изображения.  

• Пример с шариком, который движется, показывает, как это происходит.  

• Для решения проблемы можно увеличить выдержку или использовать глобальный затвор.  

• Цветные камеры используют светофильтры для каждой ячейки.  

• Это снижает разрешение и увеличивает шум.  

• Для работы с флюоресценцией лучше использовать три CCD-камеры.  

• Физическое усиление с помощью приборов ночного видения.  

• Электронное умножение E-CDD позволяет увеличить ток.  

• Это улучшает соотношение сигнала и шума.  

• Шум считывания и ближний фотонный шум.  

• Ближний фотонный шум можно уменьшить только статистикой.  

• Тепловой шум можно уменьшить охлаждением камеры.  

• Неравномерность точек камеры может создавать шум.  

• Можно использовать контрольные изображения для корректировки.  

• Важно учитывать все источники шума для получения достоверного изображения.  

• Фотодетекторы чувствительны к инфракрасному свету.  

• Использование старого микроскопа с лампочкой накаливания без инфракрасного фильтра приводит к размытию изображения.  

• Инфракрасный фильтр должен быть установлен в камере или на пути освещения микроскопа.  

• Инфракрасный свет менее токсичен для живых клеток.  

• Использование инфракрасного света позволяет наблюдать за клетками дольше без фототоксических эффектов.  

• Разрешение: количество точек должно быть в два-три раза больше, чем оптических точек микроскопа.  

• Соотношение сигнал-шум: важна хорошая выдержка для набора статистики.  

• Потеря данных при съемке: важно не терять данные при съемке ярких и темных участков.  

• Использование выдержки, яркости возбуждающего света и усиления камеры.  

• Для фиксированных препаратов: увеличение яркости возбуждающего света, затем выдержка.  

• Для живых препаратов: ограничение яркости света, использование биннинга для улучшения соотношения сигнал-шум.  

• Использование гистограмм для оценки качества изображения.  

• Избегать потери данных и пересвеченных точек.  

• Разрешение: брать минимум в два раза больше точек для качественного изображения.  

• Установка программы FIJI для следующего занятия.  

• Калибровка изображения и ручные измерения.  

• Работа с цветными изображениями и сегментация по яркости и цвету.  

• Следующая встреча завтра в 13:00.