3D-­структура хроматина и технологии ее определения (5С, HiC)

• Лекция посвящена трехмерной структуре хроматина и методам её изучения.  

• План лекции: принципы организации хроматина, экспериментальные методы, методы Hi-C, биоинформатический анализ, примеры статей.  

• ДНК в ядре уложена упорядоченно, каждая хромосома занимает свою территорию.  

• Активные гены расположены на периферии хромосомных территорий, неактивные гены внутри.  

• Гены взаимодействуют друг с другом и регулируются общими транскрипционными факторами.  

• Микроскоп позволяет увидеть структуру ДНК, но не связывает её с геномом.  

• Метод FISH использует флуоресцентные метки для точного определения позиций ДНК в ядре.  

• Метод Hi-C позволяет определить участки хроматина на периферии ядра, но имеет низкое разрешение.  

• Все методы Hi-C включают сшивание ДНК с белками формальдегидом.  

• Рестриктаза разрезает ДНК по сайтам рестрикции, создавая фрагменты.  

• Лигирование фрагментов позволяет определить последовательности ДНК и их координаты в геноме.  

• После лигирования и отмывки белков остается ДНК в виде колечек.  

• Эти колечки можно сопоставить с референсным геномом для определения координат в ядре.  

• Методы Hi-C различаются, но общий принцип остается одинаковым.  

• Конструируется пара праймеров рядом с рестриктным сайтом.  

• После ПЦР можно посчитать количество молекул и определить силу сигнала связывания.  

• Метод позволяет сконструировать несколько пар праймеров для разных участков генома.  

• Метод имеет ограничения из-за затрат на праймеры и подбор.  

• Подходит для таргетированного определения регуляторных элементов.  

• Не позволяет наблюдать взаимодействие промотора со всем геномом.  

• Конструируется пара праймеров для одного якоря.  

• ПЦР и секвенирование позволяют определить взаимодействие якоря с геномом.  

• Профиль покрытия генома показывает частоту взаимодействия.  

• Позволяет увидеть больше пар взаимодействий.  

• Праймеры пришиваются с адаптерной последовательностью для специфического секвенирования.  

• Карта взаимодействий показывает количество ридов с определенными праймерами.  

• Используется для изучения взаимодействий через определенный белок.  

• Антитела специфичны к белку, что позволяет выделить только нужные взаимодействия.  

• Метод имеет недостаток: секвенируются ненужные фрагменты ДНК.  

• Позволяет делать полногеномные карты взаимодействий хроматина.  

• Биотинилирование рестриктных сайтов позволяет исключить ненужные фрагменты.  

• Метод экономит деньги на секвенирование и предоставляет точную информацию о контактах.  

• Метод создает полногеномную карту, похожую на карту Хаси.  

• Карта показывает количество видов, у которых один рит из пары приходится на определенный участок.  

• Цвет ячейки указывает на интенсивность взаимодействия между участками.  

• Бенды — это сегменты хромосом, названные по плотности.  

• Метод Хаси имеет аналоги, такие как три сек и тезарит конформ кчер.  

• Эти методы используют подложку для предотвращения случайного лигирования.  

• Карта взаимодействий Хаси делится на ожидаемую карту для устранения линейного расстояния.  

• Это улучшает восприятие сигнала и устраняет искажения.  

• Метод Либерманайда 2009 года использует пиршский коэффициент корреляции для сглаживания карты.  

• Это позволяет понять, насколько часто регион контактирует с другими регионами генома.  

• Метод главных компонентов понижает размерность матрицы, выявляя основной сигнал.  

• Это позволяет определить компартменты А и Б, содержащие активный и неактивный хроматин.  

• Карты Хаси используются для воссоздания трехмерной структуры хроматина в ядре.  

• Учет информации Хаси помогает моделировать хромосомы в ядре, что соответствует биологическим наблюдениям.  

• Эксперимент с секвенатором Illumina.  

• Два популярных метода анализа данных: метод Яхтана и метод Макаева.  

• Оба метода нормализуют матрицу контактов и исправляют погрешности.  

• Картирование ридов на геном с помощью стандартного картировщика.  

• Рекомендуется картировать левые и правые половинки ридов отдельно.  

• Восстановление парной информации после картирования.  

• Удаление ридов, соответствующих одному и тому же фрагменту.  

• Удаление ридов с одинаковыми левыми и правыми половинами.  

• Удаление ридов с очень большими или маленькими фрагментами.  

• Объединение ридов в бины фиксированного размера.  

• Проверка и удаление бинов с высоким или низким покрытием.  

• Удаление бинов с артефактами, такими как перекос состава.  

• Гипотеза о равномерном взаимодействии участков генома.  

• Выравнивание суммы по столбцам и строкам матрицы.  

• Получение матрицы с равномерным взаимодействием участков генома.  

• Получение матрицы с контактами, близкими к диагонали.  

• Выявление ярких участков, возможно, функциональных контактов.  

• Домашнее задание: получить и обработать данные, следуя описанным этапам.  

• Геном дрозофилы состоит из нескольких хромосом: вторая, третья, четвертая и X.  

• Карта хромосом выглядит как треугольник, где треугольники соответствуют топологически ассоциированным доменам TAD.  

• TADs представляют собой клубочки хроматина, а линкеры между ними - неактивные участки.  

• TADs содержат мало генов и плохо экспрессируются.  

• Линкеры, напротив, содержат много генов и активно экспрессируются.  

• Вопрос: что определяет структуру хроматина и почему TADs и линкеры существуют?  

• Программа Armatus предсказывает TADs по матрицам H3K27ac.  

• Программа может предсказывать несколько разбиений одного участка.  

• TADs имеют иерархическую структуру, где маленькие TADs могут объединяться в большие.  

• Статья 2012 года показала, что структура TADs консервативна между организмами.  

• На границах TADs обнаружены инсуляторные белки и гены домашнего хозяйства.  

• Эти элементы могут определять структуру TADs, но их роль остается неясной.  

• Исследование на дрозофиле показало, что инсуляторные белки блокируют взаимодействие между генами из соседних TADs.  

• Гипотеза: инсуляторные белки предотвращают слияние TADs, но это не подтверждено.  

• Возможно, структура TADs определяется просто активностью генов в линкерах.  

• Разные эпигенетические метки, такие как модификации гистонов, создают множество профилей активности в геноме.  

• В 2011 году Петр Харченко разработал алгоритм, объединяющий сигналы от разных меток для определения активности участков генома.  

• Геном был сегментирован на четыре группы: красный цвет для активных участков, желтый для менее активных, синий для неактивных и черный для гетерохроматина.  

• В статье в журнале Cell показали, что деплеция белков, таких как сити-сев и когезин, не сильно влияет на структуру хроматина.  

• Эксперименты показали, что структура хроматина сохраняется, хотя и с небольшими изменениями.  

• В недавней работе в журнале Cell использовали Hi-C для секвенирования 5 терабайт данных.  

• Обнаружили, что компартменты в клетках можно разделить на подкомпартменты.  

• Показано, что между тадами ДНК свернута в петли, поддерживаемые белком сити-сев.  

• В этой статье удалось построить диплоидные карты Hi-C, что ранее было невозможно из-за низкого разрешения.  

• Фазирование ридов позволило различать контакты между разными копиями хромосом.  

• Сравнение Hi-C между мышью, обезьяной и собакой показало, что структура тадов сохраняется между организмами.  

• Изменения происходят в основном на линкерах между тадами, что подтверждает важность тадов для регуляции генома.  

• Разрешение Hi-C зависит от длины строительного фрагмента и типа рестриктазы.  

• Использование рестриктаз, расщепляющих по четырем сайтам, улучшает разрешение.  

• Однако, увеличение длины фрагментов увеличивает вероятность легирования и шума.  

• Домашнее задание доступно на сайте, инструкции по отправке писем с вопросами и заданиями.