Лекция №4. Культивирование бактерий.

• Обсуждение идентификации микроорганизмов, в частности бактерий.  

• Культивирование бактерий для последующей идентификации.  

• Бактерии размножаются через неконтролируемый рост.  

• Бактерии поглощают питательные вещества и увеличиваются в размерах.  

• При достижении предельного размера бактерия делится пополам.  

• Фаза роста с последующим делением бинарно.  

• Удвоение генетического материала ДНК и плазмидов.  

• Расхождение генетического материала к полюсам клетки.  

• Образование двух дочерних клеток, идентичных материнской.  

• Питательная среда поддерживает рост микроорганизмов.  

• Классификация питательных сред: жидкие, полужидкие, плотные.  

• Преимущества жидких сред: быстрый обмен веществ.  

• Плотные среды могут быть в виде столбика агара или скошенного агара.  

• Скошенный агар используется для накопления микроорганизмов.  

• Столбик агара применяется для индикации и выращивания бактерий, боящихся кислорода.  

• Чашки Петри имеют большую поверхность для посева.  

• Используются для посева первичного материала и выявления множества микроорганизмов.  

• Изучение свойств микроорганизмов для диагностики.  

• Сравнение с известными данными для определения вида.  

• Диффузный рост: равномерное загрязнение среды.  

• Придонный рост: микроорганизмы оседают на дне.  

• Пристеночный рост: налет на стенках пробирки.  

• Рост сгустков: комочки в прозрачной среде.  

• Предположения о виде микроорганизмов по характеру роста.  

• Опытные специалисты могут быстро определить тип бактерий.  

• Основным видом питательных сред в лаборатории является плотная питательная среда.  

• Основным компонентом является агар-агар, получаемый из морских водорослей.  

• Агар-агар легко добывается и не требует сложного производства.  

• Агар-агар представляет собой микроскопическую губку с множеством пор.  

• Он удерживает питательные вещества, но не связывает их.  

• Агар-агар нейтрален для роста бактерий и не подавляет их.  

• Агар-агар прозрачный, что важно для визуальной оценки бактерий.  

• Он не растворяется и не исчезает, сохраняя свой вид.  

• Низкая себестоимость и экологическая безопасность.  

• Плотные питательные среды используются для получения колоний бактерий.  

• Колония происходит из одной материнской клетки и является чистой культурой.  

• Колонии помогают в идентификации бактерий.  

• Размер колонии измеряется на изолированных участках агара.  

• Форма колонии может быть правильной, неправильной, амебовидной, резоидной или мицелиальной.  

• Форма изучается визуально и с помощью микроскопа.  

• Профиль колоний может быть плоским, приподнятым, кратерообразным или конусовидным.  

• Цвет колонии зависит от пигмента, продуцируемого микроорганизмом.  

• Цвет изучается на средах без индикаторов.  

• Прозрачность колоний изучается на просвет.  

• Текстура поверхности может быть однородной, блестящей, мелкозернистой, шероховатой или волокнистой.  

• Оценка краев колоний проводится с помощью микроскопа.  

• Продукция пигмента может изменять цвет питательной среды вокруг колонии.  

• Гемолиз проявляется в разрушении клеток на агаре с содержанием клеток.  

• Цвет среды остается неизменным, но в прозрачной среде видны изменения.  

• Колонии могут быть плотными, слизистыми или рассыпчатыми.  

• Плотные колонии трудно отделить от поверхности агара.  

• Слизистые колонии тянутся за петлей, как плавленный сыр.  

• Рассыпчатые колонии рассыпаются на мелкие крупинки.  

• С-колонии имеют ровную форму, гладкие края и блестящую поверхность.  

• Р-колонии имеют неправильную форму, неровные края и матовую поверхность.  

• Эти различия обусловлены адаптацией бактерий к разным условиям.  

• Свойства колонии отражают суммарные свойства миллионов клеток.  

• Колонии из клинического материала имеют слизистую капсулу и адаптированы к высоким температурам.  

• Колонии из окружающей среды имеют плотную клеточную стенку и адаптированы к агрессивным условиям.  

• Появление Р-колонии среди С-колоний может быть результатом фенотипического изменения.  

• Это не означает нечистую культуру, а адаптацию бактерии к новым условиям.  

• Изменение свойств может быть обусловлено генетическими причинами.  

• Питательные среды делятся на простые и сложные.  

• Простые среды легко доступны и поддерживают рост неприхотливых микроорганизмов.  

• Сложные среды требуют точных компонентов и сложнее в приготовлении.  

• Синтетические среды готовятся из известных компонентов и позволяют точно регулировать состав.  

• Обогащенные среды содержат дополнительные компоненты, такие как кровь или желток, для культивирования привередливых микроорганизмов.  

• Среды обогащения стимулируют рост конкретного микроорганизма.  

• Селективные среды подавляют рост нежелательных бактерий, сохраняя нужный микроорганизм.  

• Индикаторные среды содержат индикаторы, меняющие цвет в зависимости от условий.  

• Пример: агар Киллера, который меняет цвет при закислении среды или появлении сероводорода.  

• Используются для дифференциальной диагностики энтеробактерий.  

• По цвету среды можно судить об утилизации глюкозы, лактозы и продуцировании газов.  

• Приподнятый столбик агара указывает на газообразование.  

• Индикаторные среды часто являются дифференциально-диагностическими.  

• Хромогенные среды содержат специальные компоненты, реагирующие на ферменты микроорганизмов.  

• Цвет колоний позволяет идентифицировать микроорганизмы.  

• Хромогенные среды экономят время и финансы, но требуют предварительного понимания патогена.  

• Бактерии нуждаются в углеводах, углероде и азоте для роста.  

• Питательные среды должны содержать все необходимые компоненты.  

• Иногда добавляются факторы роста и макро- и микроэлементы.  

• Современные питательные среды поставляются в готовом виде.  

• Ранее среды варились вручную, сейчас производители следят за составом.  

• Лаборанты знают рецепты приготовления сред, но не досконально их состав.  

• Основная задача посева – получить изолированные колонии бактерий.  

• Метод Гольда используется для уменьшения концентрации бактерий и их механического разобщения.  

• Посев проводится штрихообразными движениями от стенки к стенке.  

• Капля исследуемой культуры засевается в один сектор чашки.  

• Петля стерилизуется и переносится часть бактерий во второй сектор.  

• Методика посева может варьироваться в разных лабораториях.  

• Перенос бактерий из первого сектора во второй, механически разделяя их.  

• Прокаливание петли между секторами для уничтожения бактерий.  

• Засев третьего и четвертого секторов для получения изолированных колоний.  

• Уменьшение концентрации бактерий от сектора к сектору.  

• В первом секторе сплошной рост бактерий, во втором появляются единичные колонии.  

• В третьем и четвертом секторах крупные изолированные колонии.  

• Использование шпателя для распределения культуры по поверхности агара.  

• Засев нескольких чашек для уменьшения концентрации бактерий.  

• Получение изолированных колоний на третьей чашке.  

• Разведение материала в пробирках для уменьшения концентрации бактерий.  

• Опасность потери патогена при разведении.  

• Увеличение стоимости метода из-за использования нескольких чашек.  

• Лак-фаза: адаптация бактерий к новым условиям, без размножения.  

• Экспоненциальная фаза: быстрый рост бактерий при благоприятных условиях.  

• Стационарная фаза: равномерный рост, борьба за выживание.  

• Фаза истощения: уменьшение количества живых клеток, гибель культуры.  

• Некоторые бактерии выделяют вещества при гибели, которые используются для роста новых бактерий.  

• Это создает фазу стабильного состояния, где бактерии растут и гибнут циклически.  

• Такой баланс может поддерживаться длительное время.  

• Исследования бактериальной культуры должны проводиться в фазе стабильного роста.  

• Слишком раннее или слишком позднее взятие бактерий может дать неполноценные результаты.  

• Длительность фаз роста известна для каждого микроорганизма, и есть рекомендации по культивированию.  

• Микроорганизмы делятся на пять групп по потребности в кислороде: строгие аэробы, строгие анаэробы, факультативные анаэробы, аэротолерантные и микроаэрофильные.  

• Знание группы микроорганизма необходимо для создания комфортных условий.  

• Методы создания анаэробных условий включают использование столбиков агара, пробирок с теплым агаром и пипеток.  

• Эти методы позволяют минимизировать доступ кислорода к бактериям.  

• Метод Элемента Фортнера использует чашки Петри с перегородкой для разделения аэробных и анаэробных культур.  

• Свечные камеры и вакуумные насосы создают анаэробные условия, удаляя кислород.  

• Вакуумные насосы позволяют создавать герметичные сосуды для культивирования микроорганизмов без кислорода.  

• Это более эффективный метод по сравнению с традиционными методами.  

• Метод создает отрицательное давление, что негативно влияет на бактерии.  

• Удаляются все компоненты воздуха, включая азот и углекислый газ.  

• Необходимость периодического контроля давления и удаления воздуха.  

• Использует герметичные пластиковые чаши.  

• Химические реагенты регулируют кислород.  

• Пакеты активны несколько суток, поддерживают ровные условия.  

• Нет необходимости контролировать давление.  

• Химические вещества редуцируют кислород.  

• Чашечки можно помещать в обычный термостат.  

• Используют клапаны и трубки для подачи газов.  

• Прибор дозирует и контролирует газовый состав.  

• Печатный аппарат документирует газовый состав смеси.  

• Совмещают термостат и анаэробную камеру.  

• Автоматически замещают газовую смесь.  

• Позволяют проводить исследования без доступа кислорода.  

• Высокая стоимость и сложность обслуживания.  

• Используются в специализированных лабораториях.  

• В обычных лабораториях применяются менее дорогие системы.  

• Температурный оптимум – наилучшая температура для роста бактерий.  

• Температурный диапазон – коридор, в котором бактерии могут расти.  

• Мезофильные бактерии имеют оптимум 35-37°C и диапазон 25-40°C.  

• Основные патогены человека.  

• Способны выживать при температуре до 40°C.  

• Культивирование проводится при 35-37°C в термостатах.  

• Психофильные бактерии предпочитают температуру от 20 до -7°C.  

• Они могут выживать в холодильнике и вызывать кишечные инфекции.  

• Могут приводить к порче продуктов и проблемам со здоровьем.  

• Термофильные бактерии живут при температуре 55-80°C.  

• Основные патогенные термофилы: квастриги и бациллы.  

• Споры термофильных бактерий могут выживать в продуктах и прорастать при определенных условиях.  

• При недостаточной термической обработке споры могут сохраняться в продуктах.  

• При остывании продукта споры прорастают и продуцируют токсины.  

• Употребление таких продуктов может вызвать заболевания.  

• Экстремально термофильные бактерии живут при температуре до 250°C.  

• Они не вызывают патологий у человека, но интересны ученым.  

• Изучение этих бактерий может помочь понять, как защищать клетки от температурных воздействий.  

• Используются инкубаторы и термостаты.  

• Маленькие камеры удобны для небольших объемов образцов.  

• Большие камеры с зеркальным покрытием лучше сохраняют тепло.  

• Изучаются сахаролитические, протеолитические и гемолитические свойства.  

• Сахаролитические свойства: утилизация сахаров, образование газа и кислоты.  

• Протолитические свойства: разжижение желатина, изменение консистенции молока.  

• Гемолитические свойства: разрушение эритроцитов, образование желтой зоны вокруг колонии.  

• Используется оксидативный ферментативный тест ОФТ.  

• Среда Хью Лейфсона изначально зеленая, после засева становится желтой.  

• Если цвет меняется только в открытой пробирке, бактерия аэроб.  

• Если в закрытой пробирке, бактерия анаэроб.  

• Если в обеих пробирках, бактерия факультативный анаэроб.  

• Используются коммерческие системы с флаконами и индикаторами.  

• Подвижность микроорганизмов определяется по изменению цвета среды.  

• Сравнение полученных свойств с известными помогает идентифицировать микроорганизмы.  

• Сравнение результатов тестов с таблицами для идентификации.  

• Долгое время идентификация происходила через биохимические тесты.  

• Современные системы упрощают работу врачей.  

• Появление автоматических тест-систем с картриджами.  

• Приборы автоматически выращивают микроорганизмы и оценивают биохимическую активность.  

• Недостатки: высокая стоимость и ограниченность базы данных.  

• Новый метод идентификации бактерий.  

• Использование металлической микроплашечки и лазера для анализа культуры.  

• Быстрое получение видовой идентификации за несколько секунд.  

• Важность культурального метода для определения чувствительности к антибиотикам.  

• Алгоритм тестирования включает четыре дня исследования.  

• Первый день: окраска по Граму и посев на питательные среды.  

• Второй день: оценка свойств колоний и пересев на скошенную среду.  

• Третий день: оценка биохимической активности и определение чувствительности к антибиотикам.  

• Четвертый день: учет биохимической активности, идентификация и оценка чувствительности.  

• Процесс идентификации микроорганизмов может быть трудоемким.  

• Врачи часто не понимают сложности идентификации бактерий.  

• Лекция завершается, алгоритм будет рассмотрен на практических занятиях.