Как Работает Секвенирование По Сэнгеру? (Классический метод Сэнгера)

• Метод секвенирования ДНК по Сэнгеру был разработан Фредериком Сэнгером и его коллегами из Кембриджского университета в 1977 году.  

• Метод включает синтез ДНК in vitro на основе принципа и биохимии репликации ДНК.  

• Для синтеза ДНК in vitro необходимы матрица ДНК, букварь, кислородные нуклеотиды, днк-полимераза и дезоксинуклеотиды.  

• Дезоксинуклеотиды - это модифицированные нуклеотиды, которые используются в методе секвенирования по Сэнгеру.  

• Они имеют гидроксильную группу в трех основных положениях сахара, что позволяет им участвовать в образовании фосфодиэфирной связи во время синтеза ДНК.  

• Метод секвенирования по Сэнгеру состоит из четырех отдельных реакций, которые протекают параллельно.  

• В каждой реакции используются матрица ДНК, праймер ДНК, днк-полимераза и четыре стандартных дезоксинуклеотида (ДНТФ).  

• В каждую реакцию добавляется небольшое количество одного дезоксинуклеотида (ddNTP), который отличается в каждой реакции.  

• После завершения четырех параллельных реакций, фрагменты ДНК разделяются с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.  

• Последовательность сегмента ДНК определяется на основе авторадиограммы геля, полученной после излучения радиоактивного материала, присутствующего в частичных фрагментах ДНК.  

• Последовательность считывается снизу вверх в соответствии с увеличивающимся размером фрагментов.